SDS-PAGE تکنیکی است که در آن مولکولهای زیستی بر اساس اندازه جداسازی می شود . مولکولهایی چون انواع پروتئین ها , RNA , DNA . ژل آگاروز برای درشت مولکولهایی مانند DNA بهترین گزینه است . SDS-PAGE برای پروتئین های کوچکتر بهتر است .
مواردی که SDS-PAGE کاربرد دارد عبارت است از :
۱- تصدیق اندازه پروتئین ها
۲- شناسایی پروتئین ها
۳- تعیین خلوص پروتئین ها
۴- شناسایی پیوند های دی سولفید
۵- کمیت و مقدار پروتئین ها
۶- آشکار کردن عیوب
SDS یک دترجنت و مخفف sodium dodecyl sulfate می باشد . بعد از اضافه کردن آن , و احاطه کردن پروتئین ها , پروتئین ها بار نسبتا همسان پیدا کرده و به صورت خطی در می آیند . بدین ترتیب جداسازی فقط بر اساس اندازه صورت می پذیرد . تعداد مولکولهای SDS متناسب با تعداد آمینواسیدهای یک پروتئین است . هر مولکول SDS دو بار منفی به پروتئین می دهد . همچنین باعث می شود که نیرو هایی که در تا شدن و تغییر شکل دادن پروتئین ها شرکت می کنند , از بین بروند .
ژل پلی اکریل آمید همانند ژل آگاروز بر اساس اندازه مولکولها , جداسازی می کند . ژل اکریل آمید با پیوندهای عرضی که دارد , مکانی را برای الک کردن مولکولهایی که در اثر جریان الکتریکی در حال عبور می باشند , به وجود می آورد . همه پروتئین هایی که دارای بار منفی هستند , توسط انتهای میدان الکتریکی که دارای بار مثبت می باشد , کشیده می شود , اما شبکه پلیمری در برابر حرکت آنها مقاومت می کند . پروتئین های کوچکتر سریعتر از مولکولهای درشت تر در این شبکه , حرکت می کنند . در نتیجه از مولکولهای درشت تر پایین تر قرار می گیرند . پس جداسازی در روش SDS-PAGE فقط بر اساس اختلاف در اندازه مولکولها می باشد .
پس از اینکه ژل Run شد , شما احتیاج دارید که پروتئین ها را بر روی ژل فیکس کنید . تا پروتئین ها از جای خود حرکت نکند . اسید استیک 25% یک فیکس کننده خوب است و باعث دناتوره شدن پروتئین می گردد . ژل توسط یک رنگ مثل coomasie blue R250 رنگ می شود . رنگ و تثبیت کننده را می توان در یک محلول که حلال آن متانول است به طور همزمان استفاده کرد . رنگ در کل ژل پخش شده و با پروتئین ها کمپلکس می شود(staining) . سپس با یک محلول که حاوی اسید استیک و متانول است ژل شسته می شود تا رنگ از ژل خارج شود و فقط رنگی که با پروتئین ها باند شده است باقی بماند (destain).
بدون SDS , پروتئین با ساختمان اولیه خود و بدون تغییر بار جداسازی می شود , که در این روش جرم مولکولی و بار isoelectric در جداسازی تآثیر گذار است و این روش PAGE نام دارد . SDS تقریبا به نسبت 1.4g برای هر یک گرم پروتئین استفاده می شود .(این نسبت بین 1.1g الی 2.2g SDS برای هر گرم پروتئین تغییر می کند) .
اندازه منافذ SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis :
بیشتر پروتئین ها و نوکلوئیک اسیدها با اندازه و شکل های متفاوت دارای ضریب بار/جرم تقریبا یکسانی هستند . الکتروفورز این مولکولها در محیط مایع , باعث جداسازی مناسبی نمی شود . اما الکتروفورز در محیط ژل (سوسپانسیون نیمه جامد در آب) نتیجه بهتری می دهد . جداسازی پروتئین ها بطور معمول در ژلهای پلی اکریل آمید انجام می شود . این ژل ها توسط پلیمره شدن محلولی از مونومر اکریل آمید که قالب آن از دو شیشه تشکیل شده است , درست می شود . میزان درشتی و ریزی منفذهای پلیمر متناسب است با غلظت پلی اکریل آمید و عامل بوجود آورنده پیوند های عرضی. وقتی یک مخلوط از پروتئین در ژل و در میدان الکتریکی ایجاد شده قرار می گیرد , پروتئین های کوچکتر سریعتر از درشت مولکولها از میان منافذ ژل حرکت می کنند . میزان جابجایی به اندازه منافذ ژل و قدرت میدان الکتریکی بستگی دارد . پس مولکولهای کوچکتر راحت تر از منافذ عبور کرده , در حالی که درشت مولکولها به راحتی جابجا نمی شوند .
در این متد مخلوط پروتئین و SDS که یک دترجنت آنیونی است , توسط گرما با هم باند شده اند . لذا پروتئین ها دیگر ساختمان اولیه را ندارند و فاقد پیوندهای دی سولفید هستند .
ردیابی رنگ در الکتروفورز :
رنگ به کار رفته در محلول پروتئین به آزمایش کننده این امکان را می دهد که متوجه شود پروسه چه میزان پیش رفته است و آیا مدت زمان جداسازی کافی بوده است یا خیر .
عناصر سازنده شیمیایی و نقش آنها :
اندازه مناذ را 2 فاکتور کنترل می کند .(T%) مقدار درصد acrylamide و مقدار پیوندهای عرضی (C%) . کل غلظت مونومر acrylamide-bisacrylamide = T و غلظت عامل پیوند دهنده عرضی = C . اندازه منافذ با افزایش T% کاهش می یابد و با عامل پیوند دهنده عرضی 5% کوچکترین اندازه منفذ را می دهد . هرگونه افزایش و یا کاهشی در C% باعث افزایش اندازه منفذ می شود , زیرا رابطه اندازه منفذ با C% یک رابطه پارابولیک (سهمی گونه) است . و مینیمم آن در 5% می باشد . دو لایه در ژل وجود دارد . یکی stacking و دیگری separating .
*** >>> استفاده از مطالب این وبلاگ بدون ذکر منبع جایز نیست <<< ***
|
روز بخير كاربر مهمان! 
